組培室的污染來源一般可分為以下幾方面:接種前污染、接種時污染、接種后污染、母本帶菌。
一、接種前污染:培養(yǎng)基消毒不徹底
1、現(xiàn)象
培養(yǎng)基消毒不徹底,污染一般呈碟狀出現(xiàn)在培養(yǎng)基內(nèi)部,但也有在培養(yǎng)基表面或者瓶壁、瓶蓋表面出現(xiàn)的。
2、原因
原因可能是由于滅菌鍋加熱不均勻,培養(yǎng)基量太多,瓶子沒洗干凈等。
3、應(yīng)對
取若干批次培養(yǎng)基放置1~2周,觀察污染出現(xiàn)情況,即可對滅菌成功率做出合適的評價。將培養(yǎng)基放置1周左右再用,可以實時監(jiān)控滅菌成功率的同時具備較大的使用緩沖時間,以應(yīng)對滅菌鍋失效等突發(fā)情況。
二、接種時污染:員工操作或者相關(guān)除菌設(shè)備失效
1、現(xiàn)象
接種時帶來污染,污染物一般貼著培養(yǎng)物生長,但少數(shù)情況下污染物也可能隨機散布在培養(yǎng)基表面。
2、原因
這方面的原因包括員工操作不符合無菌操作要求,超凈工作臺高效過濾器失效,超凈工作臺風(fēng)速過低,超凈工作臺表面沒做好消毒,接種器具消毒不徹底。組培工廠一般員工的污染率通常在3%左右,而由技術(shù)員進行嚴(yán)格的接種操作時,污染率可控制到1%以下。如果一個組培工廠接種人員之間的污染率差異巨大,就應(yīng)該在“接種時污染”這個方面去著手,尋求解決辦法。
3、應(yīng)對
應(yīng)對的措施一般有定期檢測機臺過濾效果,檢測機臺氣流大小,規(guī)范員工操作,檢測高溫消毒器,檢測鐵盤或者紙片的消毒效果。
三、接種后污染:培養(yǎng)過程中,由氣流或小動物帶來污染
1、現(xiàn)象
污染物一般散布在培養(yǎng)基表面,而不是貼著培養(yǎng)物生長。有時由小動物如螨蟲或者薊馬帶入時,還能在瓶內(nèi)看到微小的爬動的蟲子,這時的菌類污染物可能從瓶蓋或者瓶壁向下生長,也可能在培養(yǎng)基表面長出彎彎曲曲的軌跡(沿著蟲子爬行的足跡生長),螨蟲污染的情況下,能觀察到瓶壁有蛛網(wǎng)狀細(xì)絲。
2、原因
原因可能是培養(yǎng)間潔凈度較差,氣流較快,使灰塵飄動較多;緩沖不良使薊馬飛入;培養(yǎng)間人員衣著不規(guī)范帶來較多螨蟲;或者沒有對污染進行定期的監(jiān)控,使蟲子帶來的污染有擴散的機會。
3、應(yīng)對
首先應(yīng)該分清污染源。如果發(fā)現(xiàn)污染有在瓶間擴散的跡象,最可能是蟲子帶來的污染。應(yīng)即刻擰緊污染瓶蓋并清除污染瓶。平時應(yīng)注意培養(yǎng)間的緩沖區(qū)效果,規(guī)范員工衣著,定期清潔培養(yǎng)間,如每周拖兩次地。培養(yǎng)間內(nèi)可設(shè)置每晚臭氧消毒。最有效的措施還是定期檢查并清除污染。
4、關(guān)于螨蟲污染
這里再補充一下個人看法。在一般潔凈程度的培養(yǎng)環(huán)境下,螨蟲會隨機出現(xiàn)。畢竟人體就帶有螨蟲。
觀察到螨蟲污染時,有更多未觀察到的母瓶已經(jīng)被污染。因為螨蟲從瓶口爬到培養(yǎng)基上,在真菌菌落長出前這個階段不能被觀察到。當(dāng)1筐材料有較多污染時應(yīng)立即整筐丟棄。
有螨蟲在瓶口螺旋內(nèi)未能進入瓶內(nèi),這樣的母瓶在轉(zhuǎn)瓶前一直是潔凈的,在轉(zhuǎn)瓶后會爆發(fā)污染。
可能有少量不帶霉菌孢子的螨蟲進入瓶內(nèi),因而不能被觀察到。這樣的母瓶會被忽視并成為隱藏的傳染源。當(dāng)螨蟲在瓶內(nèi)大量繁殖,在瓶口進進出出,最終會出現(xiàn)真菌污染。
為控制螨蟲污染,篩查是最主要措施,打藥效果并不明確。篩查操作應(yīng)該每3~7天一次,堅持到整個培養(yǎng)間的螨蟲污染率降到0.1%以下。然后每周全面清理霉菌污染,直到未發(fā)現(xiàn)疑似螨蟲污染。
遇到螨蟲爆發(fā),往往是平時管理不善。這時看到明顯污染的只是一部分,更多的瓶子已經(jīng)有螨蟲但未能被輕易觀察到。因此發(fā)現(xiàn)螨蟲爆發(fā)后即使立即清理污染瓶,后續(xù)還是會出現(xiàn)污染持續(xù)增多的現(xiàn)象。配合著堅持篩查,污染量出現(xiàn)高峰后會逐漸下降,而整個“螨蟲病程”估計將持續(xù)2~3個培養(yǎng)周期。應(yīng)對措施良好的情況下,3個周期后應(yīng)該能將螨蟲量控制到正常的水平,但此后也應(yīng)該有持續(xù)的監(jiān)控措施。
四、母本帶菌:組培物本身有內(nèi)生菌,或外植體消毒時保留了輕微帶菌的材料
1、現(xiàn)象
這類污染必然緊貼著培養(yǎng)物表面開始出現(xiàn)的。這類污染既然能被保留下來,進行帶菌組培,一般生長較緩慢,在培養(yǎng)基內(nèi)呈較難觀察到絲狀。但隨著培養(yǎng)代數(shù)增加,污染物的生長速度也可能變快,污染變明顯(原因可能是經(jīng)過較長時間細(xì)菌出現(xiàn)了快速生長的變異,然后占據(jù)了生長優(yōu)勢)。
2、原因
一般植物體內(nèi)都或多或少地有內(nèi)生菌。輕微的污染不易被察覺,也不太影響培養(yǎng)物的生長,易被保留。
3、應(yīng)對
對于有內(nèi)生菌問題,那就嘗試使用沒有內(nèi)生菌的材料,包括莖尖脫毒處理等。同一批母本得到的培養(yǎng)物,也可能有少部分不含內(nèi)生菌的材料,仔細(xì)挑選著部分材料進行擴繁,其余的也可利用幾代。如果內(nèi)生菌一直不影響組培物生長,也可以無視。
對于輕微污染的情況,應(yīng)該在一開始就盡可能仔細(xì)地挑選出無菌材料進行重點擴繁。當(dāng)然,合適的接種操作也可以將輕微污染一直控制在可控的范圍,如每次轉(zhuǎn)瓶時都切除所有老組織,只用新的組織進行擴繁或出苗。