組培室的污染來源一般可分為以下幾方面：接種前污染、接種時污染、接種后污染、母本帶菌。

一、接種前污染：培養(yǎng)基消毒不徹底

1、現(xiàn)象

培養(yǎng)基消毒不徹底，污染一般呈碟狀出現(xiàn)在培養(yǎng)基內(nèi)部，但也有在培養(yǎng)基表面或者瓶壁、瓶蓋表面出現(xiàn)的。

2、原因

原因可能是由于滅菌鍋加熱不均勻，培養(yǎng)基量太多，瓶子沒洗干凈等。

3、應(yīng)對

取若干批次培養(yǎng)基放置1～2周，觀察污染出現(xiàn)情況，即可對滅菌成功率做出合適的評價。將培養(yǎng)基放置1周左右再用，可以實時監(jiān)控滅菌成功率的同時具備較大的使用緩沖時間，以應(yīng)對滅菌鍋失效等突發(fā)情況。

二、接種時污染：員工操作或者相關(guān)除菌設(shè)備失效

1、現(xiàn)象

接種時帶來污染，污染物一般貼著培養(yǎng)物生長，但少數(shù)情況下污染物也可能隨機散布在培養(yǎng)基表面。

2、原因

這方面的原因包括員工操作不符合無菌操作要求，超凈工作臺高效過濾器失效，超凈工作臺風(fēng)速過低，超凈工作臺表面沒做好消毒，接種器具消毒不徹底。組培工廠一般員工的污染率通常在3%左右，而由技術(shù)員進行嚴(yán)格的接種操作時，污染率可控制到1%以下。如果一個組培工廠接種人員之間的污染率差異巨大，就應(yīng)該在“接種時污染”這個方面去著手，尋求解決辦法。

3、應(yīng)對

應(yīng)對的措施一般有定期檢測機臺過濾效果，檢測機臺氣流大小，規(guī)范員工操作，檢測高溫消毒器，檢測鐵盤或者紙片的消毒效果。

三、接種后污染：培養(yǎng)過程中，由氣流或小動物帶來污染

1、現(xiàn)象

污染物一般散布在培養(yǎng)基表面，而不是貼著培養(yǎng)物生長。有時由小動物如螨蟲或者薊馬帶入時，還能在瓶內(nèi)看到微小的爬動的蟲子，這時的菌類污染物可能從瓶蓋或者瓶壁向下生長，也可能在培養(yǎng)基表面長出彎彎曲曲的軌跡（沿著蟲子爬行的足跡生長），螨蟲污染的情況下，能觀察到瓶壁有蛛網(wǎng)狀細(xì)絲。

2、原因

原因可能是培養(yǎng)間潔凈度較差，氣流較快，使灰塵飄動較多；緩沖不良使薊馬飛入；培養(yǎng)間人員衣著不規(guī)范帶來較多螨蟲；或者沒有對污染進行定期的監(jiān)控，使蟲子帶來的污染有擴散的機會。

3、應(yīng)對

首先應(yīng)該分清污染源。如果發(fā)現(xiàn)污染有在瓶間擴散的跡象，最可能是蟲子帶來的污染。應(yīng)即刻擰緊污染瓶蓋并清除污染瓶。平時應(yīng)注意培養(yǎng)間的緩沖區(qū)效果，規(guī)范員工衣著，定期清潔培養(yǎng)間，如每周拖兩次地。培養(yǎng)間內(nèi)可設(shè)置每晚臭氧消毒。最有效的措施還是定期檢查并清除污染。

4、關(guān)于螨蟲污染

這里再補充一下個人看法。在一般潔凈程度的培養(yǎng)環(huán)境下，螨蟲會隨機出現(xiàn)。畢竟人體就帶有螨蟲。

觀察到螨蟲污染時，有更多未觀察到的母瓶已經(jīng)被污染。因為螨蟲從瓶口爬到培養(yǎng)基上，在真菌菌落長出前這個階段不能被觀察到。當(dāng)1筐材料有較多污染時應(yīng)立即整筐丟棄。

有螨蟲在瓶口螺旋內(nèi)未能進入瓶內(nèi)，這樣的母瓶在轉(zhuǎn)瓶前一直是潔凈的，在轉(zhuǎn)瓶后會爆發(fā)污染。

可能有少量不帶霉菌孢子的螨蟲進入瓶內(nèi)，因而不能被觀察到。這樣的母瓶會被忽視并成為隱藏的傳染源。當(dāng)螨蟲在瓶內(nèi)大量繁殖，在瓶口進進出出，最終會出現(xiàn)真菌污染。

為控制螨蟲污染，篩查是最主要措施，打藥效果并不明確。篩查操作應(yīng)該每3～7天一次，堅持到整個培養(yǎng)間的螨蟲污染率降到0.1%以下。然后每周全面清理霉菌污染，直到未發(fā)現(xiàn)疑似螨蟲污染。

遇到螨蟲爆發(fā)，往往是平時管理不善。這時看到明顯污染的只是一部分，更多的瓶子已經(jīng)有螨蟲但未能被輕易觀察到。因此發(fā)現(xiàn)螨蟲爆發(fā)后即使立即清理污染瓶，后續(xù)還是會出現(xiàn)污染持續(xù)增多的現(xiàn)象。配合著堅持篩查，污染量出現(xiàn)高峰后會逐漸下降，而整個“螨蟲病程”估計將持續(xù)2～3個培養(yǎng)周期。應(yīng)對措施良好的情況下，3個周期后應(yīng)該能將螨蟲量控制到正常的水平，但此后也應(yīng)該有持續(xù)的監(jiān)控措施。

四、母本帶菌：組培物本身有內(nèi)生菌，或外植體消毒時保留了輕微帶菌的材料

1、現(xiàn)象

這類污染必然緊貼著培養(yǎng)物表面開始出現(xiàn)的。這類污染既然能被保留下來，進行帶菌組培，一般生長較緩慢，在培養(yǎng)基內(nèi)呈較難觀察到絲狀。但隨著培養(yǎng)代數(shù)增加，污染物的生長速度也可能變快，污染變明顯（原因可能是經(jīng)過較長時間細(xì)菌出現(xiàn)了快速生長的變異，然后占據(jù)了生長優(yōu)勢）。

2、原因

一般植物體內(nèi)都或多或少地有內(nèi)生菌。輕微的污染不易被察覺，也不太影響培養(yǎng)物的生長，易被保留。

3、應(yīng)對

對于有內(nèi)生菌問題，那就嘗試使用沒有內(nèi)生菌的材料，包括莖尖脫毒處理等。同一批母本得到的培養(yǎng)物，也可能有少部分不含內(nèi)生菌的材料，仔細(xì)挑選著部分材料進行擴繁，其余的也可利用幾代。如果內(nèi)生菌一直不影響組培物生長，也可以無視。

對于輕微污染的情況，應(yīng)該在一開始就盡可能仔細(xì)地挑選出無菌材料進行重點擴繁。當(dāng)然，合適的接種操作也可以將輕微污染一直控制在可控的范圍，如每次轉(zhuǎn)瓶時都切除所有老組織，只用新的組織進行擴繁或出苗。